Descrição

A Plataforma de Biologia Estrutural Integrada tem por objetivo fornecer infraestrutura e treinamento em todas as etapas do processo de resolução e análise estrutural de proteínas, desde sua produção recombinante, caracterização biofísica em solução, cristalização até a determinação de estruturas tridimensionais. Esta plataforma está estruturada em quatro subunidades principais: 

1) Expressão de proteínas recombinantes em células eucarióticas – a implantação desta tecnologia visa disponibilizar a possibilidade de produção de proteínas complexas, multimodulares e oligoméricas para análise estrutural cuja expressão em conformação nativa não é possível em Escherichia coli ou outros sistemas bacterianos. Para estas atividades contamos com uma sala de cultivo para células eucarióticas equipada com uma incubadora de CO2 convencional (ThermoFisher), uma incubadora de CO2 com agitação (Multitron, Infors), uma cabine de segurança biológica, um microscópio invertido e um refrigerador/freezer duplex.

2) Purificação de proteínas – a plataforma está equipada com seis cromatógrafos (ex-GE Healthcare, atual Cytiva Healthcare):

- 2 cromatógrafos ÄKTA UPC 100.

- 2 cromatógrafos ÄKTA Pure M25 com válvula para quatro opções de entrada de tampões.

- 1 cromatógrafo ÄKTA Pure M25 com bomba de injeção de amostras para uso com grandes volumes.

- 1 cromatógrafo ÄKTA Pure M25 com válvula para quatro opções de entrada de tampões e válvula para conexão múltipla para até cinco colunas.

A plataforma também disponibiliza um conjunto limitado de colunas para cromatografia de exclusão molecular (gel-filtração).

3) Caracterização biofísica e de interações moleculares – a infraestrutura disponível possibilita a) a análise do conteúdo de estruturas secundárias e/ou análise de estabilidade por dicroísmo circular (CD); b) a análise de estabilidade e/ou estado de enovelamento por medidas de fluorescência; c) a realização de ensaios baseados em análise de luminescência (fluorescência ou quimio/bio luminescência;  d) a determinação do raio hidrodinâmico e análise do estado de agregação por espalhamento dinâmico de luz (DLS); e) a determinação simultânea do estado de oligomerização/agregação e análise de desenovelamento utilizando DLS e varredura de fluorescência (nanoDSF); f) a determinação de constante de dissociação através da técnica de termoforese em microescala.

Para estas análises contamos com os seguintes equipamentos:

- Espectrômetro de dicroísmo circular Jasco J-815

- Espectrômetro de Luminescência LS-55 (Perkin Elmer): equipamento para detecção de fluorescência e quimio/bio luminescência, que opera na faixa espectral de 200 a 800 nm para excitação e 200 a 630 nm para emissão.

- Sistema de análise de espalhamento dinâmico de luz NanoStar (Wyatt Technologies).   

- Sistema de nanoDSF/DLS Prometheus Panta (Nanotemper Technologies).

- Sistema de termoforese em microescala Monolith NT115 (Nanotemper Technologies), compatível com cromóforos com excitação/emissão em 450-495/505-575 nm (azul) e 595-645/665-730 nm (vermelho)

4) Cristalização e análise estrutural de proteínas – a plataforma tem capacidade para cristalização de proteínas incluindo testes iniciais e refinamento das condições de cristalização, análise de imagem automatizada das placas de cristalização e recursos computacionais para processamento de dados de difração e análise estrutural. Os dados de difração dos cristais são obtidos externamente, em estações experimentais de difração de raios-X de proteínas de laboratórios síncrotron.

Os equipamentos disponíveis para estas atividades são:

- Robô pipetador de volumes submicrolitro para ensaios de cristalização (Mosquito, STP Labtech).

- Robô dispensador programável para pipetagem de volumes de 0,5 μL a 4 mL para preparação das combinações matriciais de soluções para otimização de cristais (Dragonfly, STP Labtech).

- Equipamento automatizado de análise de imagens (Rock Imager 2, Formulatrix).

- Microscópio ótico convencional para observação de cristais Olympus SZX16.

- Três estações de trabalho de alta performance para processamento de dados e análise estrutural.